En 2008 se formó el Consorcio denominado Esfuerzo Colaborativo Internacional para Duchenne (ICE internacional Collaborative Effort for DMD) integrado por Francia, Italia, Reino Unido y Estados Unidos, cuyos objetivos para el primer año son:
Construir herramientas y recursos necesarios para superar los diferentes cuellos de botella que actualmente previenen de iniciar ensayos clínicos con las Terapias Salto de Exón y Terapia Celular combinadas.
En la reunión de «Treat-NMD / ICE» que se llevó a cabo en Paris el 25 de noviembre de 2008 el Dr. Francesco Muntoni presentó Los Procedimientos del Proyecto Esfuerzo Colaborativo Internacional para Duchenne.
Tras 6 meses de haber lanzado este proyecto, los resultados son alentadores. Se estima que el programa se concluirá en tiempo. Con el propósito de revisar el estado de progreso a los 6 meses del primer año del programa ICE, se llevaron a cabo 2 reuniones en Enero y Junio de 2009 con la asistencia de 25 participantes que pertenecen a los 15 equipos asociados que conforman la Red ICE.
A continuación se encuentra una síntesis del material que ha sido entregado por cada uno de los Paquetes de Trabajo.
« Paquete de Trabajo 1 »: Validación of cuasi-distrofinas (distrofina trunca)
Validación de las potencialmente terapéuticas semi-distrofinas o distrofinas truncas mediante el uso de la información in silico de la base de datos Cochin UMD-DMD: la asociación de los fenotipos con sintomatología mínima o inclusive totalmente asintomáticos con deleciones en-marco que terminan en el exón 51, valida este exón como un blanco para mono salto de exón en 6 de los 7 patrones de deleciones locales corregibles mediante esta técnica. Para el modelo propuesto de corrección del exón 45 al 55 como corrección maestra, los fenotipos esperados son del tipo de Becker, pero de severidad variada. Parece que utilizar la base de datos tiene sus límites, porque la precisión de cada pieza de información molecular y clínica no se puede asegurar en cada individuo. Por lo que es un paso preliminar necesario pero no suficiente que debe ser seguido de ver los expedientes en papel y al paciente. La disponibilidad de un arreglo CGH que explore el gene DMD completo (exones + intrones) hará posible correlacionar los márgenes de la deleción con las manifestaciones clínicas.
Preparación de plásmidos cDNA diseñados «a la medida» que codifican para una variedad de las semi-distrofinas supuestamente funcionales: la metodología está dominada y se tienen 10 moléculas construidas que han sido entregadas a otros equipos para su validación en vivo.
Validación en vivo de las moléculas arriba mencionadas: Esto se ha logrado en dos modelos animales para Duchenne, (i) ratones mdx a través de entrega local intra-muscular por electro-transferencia.
(ii) en pez zebra dys null (pez distrófico que carece de istrofina) mediante la técnica de trans-génesis. Este modelo novel prometedor ha sido validado al mostrar ue puede ser rescatado por cDNA de distrofina de longitud completa humano y por varios cDNAs de cuasi-distrofinas o distrofinas truncas. Moléculas construidas genéticamente (GFP constsructs) prueban se útiles para mostrar que el material humano se adhiere a la mismas estructuras celulares como la distrofina residente (curiosamente a la parte final de las fibras exclusivamente), y no se expresa en otros tejidos más que en el músculo. La distrofina genéticamente construida (GFP-human dystrophin) fue utilizada con éxito para investigar la síntesis de proteína (o relocalización) por el método denominado foto-blanqueo o foto-decoloración (photo-bleaching – FRAP method).
La relación entre la función de la distrofina al final de las fibras y la de superficie lateral del músculo en mamíferos está pendiente de ser elucidada.
« Paquete de Trabajo 2 »: Dispositivos para Salto de Exón (Exon-skipping devices)
Desarrollo de un recurso para probar ex-vivo, la eficacia de los dispositivos actuales para Salto de Exón basados en U7 en material celular de pacientes con Duchenne. Un protocolo robusto es ahora operacional, en el cuál los miotubos (células musculares) cultivados de los pacientes se derivan sea de los cultivos de mioblastos o de los fibroblastos mio-inducidos (cuando la biopsia no es posible), entonces son transducidos con dispositivos de salto de exón mediante el uso de vectores lentil-virus (LV vectorized). Se ha obtenido con éxito el salto de exón (el mRNA esperado y la cuasi-distrofina) para los exones 51, 46, 45 y 16. Material celular de paciente con Duchenne está ahora siendo obtenido de manera rutinaria (más de 50 muestras).
Optimización de casetes para Salto de Exón basados en U7: La secuencia U7 del ratón se está reemplazando por la versión U7 humana (llamada SU7). Una etiqueta (3 – 4 nt) se agrega al extremo 5′ de la secuencia antisentido ha sido delineada ( para modelo y mutagénesis). Asegura un enlace óptimo («beso» «kissing») del lazo y patrón de doblado de la snRNP resultante. Casetes concatenados que apuntan a multi- salto de exón, han sido obtenidos y validados con éxito en perros golden retriever con distrofia muscular en los cuáles se necesita el salto de dos exones para obtener la corrección del marco de lectura.
Construcción de un casete bifuncional para salto de exón mRNA U7 para mejorar la eficacia para aquellos exones «difíciles». Lleva una secuencia antisentido que apunta hacia una secuencia adecuada específica a un exón. Ha sido validada ex – xvivo en mioblastos de pacientes con Duchenne (deleción 49 al 50) (vector LV), in vivo en ratón mdx (vector AAV), en hDMD y en ratones carentes de distrofina y utrofina los cuáles recuperaron la habilidad normal de moverse. Estos resultados están publicados (Goyenvalle et al, Mol Therapy, en línea 10 mayo 2009).
Dispositivo «Llave Maestra» o «Corrección Maestra» para salto de los exones del 45 al 55 (que corregiría un máximo de patrones de deleción): Es un problema difícial aún no resuelto ( se han probado múltiples estrategias: apuntar a 2 exones terminales, apuntar a cada exón individualmente). El hecho que esta región está sujeta a splicing alternativos previene poder probar la eficacia por el tamaño de los transcriptos, forzando la confiabilidad en la técnica de western-blotting.
Optimización de casetes para salto de exón basados en U1 para explorar el mundo de miRNA: Promotores específicos de músculo de algunos miRNA (esquelético, liso y corazón) han sido identificados y utilizados para obligar el casete de salto de exón en las moléculas construidas U1. Once promotores quiméricos miRNA han sido construidos, sectorizados en virus lentil (LV lentil-virus) y validados para saltar el exón 51.
« Paquete de Trabajo 3 »: Estrategias para Terapia Celular Autóloga
Uso de Células CD 133: Se ha avanzado en la caracterización biológica, en la purificación y la ampliación de estas células obtenidas de músculo y de sangre. Las células CD 133 tratadas con la técnica de salto de exón, tras ser administradas por vía intra-muscular, inician el proceso de salto de exón en los micro-núcleos celulares contiguos a los núcleos corregidos.
Uso de Mesoangioblastos: Se avanzó en el entendimiento del origen embriónico de estas células y los factores biológicos que orientan hacia una acción de generación de músculo.
Diseminación de la metodología de Milán a otros laboratorios del consorcio ICE: Varios sitios ya realizan el proceso de purificación con buen rendimiento. El medio para cultivar estas células lo provee Iván Torrente. Hubo acercamiento con una compañía para la elaboración industrial de este medio de muy alto costo (USD 45,000 / litro), se está negociando un mejor precio.
Mejorar la metodología para el cultivo de los precursores miogénicos (de generación muscular): Se ha diseñado un método para asegurar la diferenciación muscular de las células precursoras que potencialmente pueden generar células musculares. Consiste en una matriz de poliacrilamida / colágeno de elasticidad óptima que produce excelente viabilidad y rendimientos espectaculares de distrofina tras inyecciones intramusculares, casi del 100%. Estas células son bien toleradas de manera sorprendente, por ratones mdx, sin haber suprimido la respuesta inmunológica (Fenómeno no explicado por el momento).
« Paquete de Trabajo 4 »: Asuntos sobre Entrega Sistémica
Producción a gran escala de AAVs (adenovirus asociado): se han establecido un proceso industrial de producción en Baculovirus y protocolos de control de calidad. Se obtienen cantidades suficientes de AAV6, ahora se está aplicando la misma tecnología para producir AAV8. De manera rutinaria ya se está produciendo y entregando a la comunidad ICE.
Generación de Inmunidad de AVV6 y AVV8 en perros: La administración intracardíaca de AAV6/optU7 en perros distróficos no dio buenos resultados. La explicación que se da es que debido a la pre-existencia de anticuerpos circulantes en contra de AAV6 que los neutralizan (por la vacunación profiláctica antiparvovirus al nacimiento?). de hecho no se conoce el mecanismo de la neutralización. AAV8 que se creyó que podía ser un buen sustituto pues in vitro no se neutralizaba por el suero de los perros, de hecho también fue neutralizado en vivo pero en un menor grado.
Entrega Sistémica de rAAV6 en perros distróficos mediante circulación extra-corporal: Con el fin de superar el filtro pulmonar se ha diseñado y optimizado un protocolo en perros normales con infusión de AVV en la sangre de la arteria que entra. Dos perros con distrofia fueron inyectados en Febrero 2009, observando buena tolerancia peor mala distribución, indicando que el cuello de botella de la neutralización es todavía un problema.
Entrega de AAV al músculo cardíaco: un protocolo de entrega trans-endocardial de rAVV6 (a través de catéter) se ha establecido en perros distróficos. La selección del serotipo de AVV depende del modelo animal: AAV9 es mejor en roedores; AAV6 es mejor en perros y primates.
« Paquete de Trabajo 5 » : Preparación de estudios clínicos
Pre-escaneo In silico de pacientes candidatos: para cada uno de los patrones de rescate mono- o multi skipping, una lista puede ser obtenida al instante de la base de datos UMD_DMD francesa mediante sus herramientas internas específicamente diseñadas. Además la base de datos Cochin UMD-DMD (con 1500 datos, ie. 60% de pacientes de la base de datos nacional) está respaldada por expedientes en papel, con la información necesaria para escrutinio futuro de elegibilidad.
Desarrollo de herramientas para la evaluaión funcional de los individuos tratados: varios dispositivos existentes para medir la fuerza muscular residual han sido evaluados. Otra línea promisoria de evaluación es la acelerometría para dar a indicación global de movilidad. Parece que para niños aún en etapa de ambulación, la prueba de caminata de 6 minutos (empleada por la compañía PTC) es simple y confiable. Para paciente no-ambulatorios un nuevo dispositivo denominado Piano es útil puesto que explora la resistencia de los flexores y extensores de la mano.
Verificación de la tolerancia de células CD 133 autólogas: se realizó infusión en 5 pacientes receptores de sus propias células (no corregidas) sin observarse eventos clínicos o histológicos indeseables.
Estudio pre-clínico para investigar la tolerancia a los mesoangioblastos: esto es lo que se ha realizado (i) en humanos la proliferación y mio-genicidad (generación de células musculares) obtenida fue muy variable, lo que indica que la metodología no es aún operacional; (ii) en perros normales y distróficos, el proceso de aceptación y persistencia se ha probado utilizando células marcadas con el isótopo indio111.
« Paquete de Trabajo 6 »: Administración
Philippe Moullier (Nantes) presentó su información obtenida en primates no-humanos (macacos) y la sobrevivencia en el largo plazo de AVV después de 5 años, sin evidencia de integración.
Muriel Audit (Genosafe, Evry) expuso su experiencia en términos de bio-seguridad y cumplimiento de las regulaciones de las agencias de Bio-seguridad.
Reporte escrito por Jean-Claude Kaplan, ICE Consejo de Asesores (ICE Advisory Board) y revisado poa Terry Partridge, ICE Consejo de Asesore (ICE Advisory Board), y Luis Garcia Coordinador Científico de ICE (ICE scientific coordinator).
