Investigadores del Centro para la Investigación con Células iPS y su Aplicación (CIRA), demuestran que se pueden utilizar células madre pluripotentes inducidas (iPS) para corregir las mutaciones genéticas que causan la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD). La investigación, publicada en Stem Cell Reports, demuestra cómo la edición genómica de nucleasas de ingeniería, tales como TALEN y CRISPR, pueden ser utilizadas para modificar el genoma de las células iPS generadas a partir de las células de la piel de un paciente DMD. Las células se diferenciaban en los músculos esqueléticos, en los que la mutación responsable de DMD había desaparecido.

La DMD es una enfermedad muscular grave degenerativa causada por una mutación en el gen de la distrofina de pérdida de su función. Se produce en 1 de cada 3.500 niños y normalmente conduce a la muerte en la edad adulta. En la actualidad, no hay tratamiento disponible para los pacientes, fuera de lo que son los cuidados paliativos. Una opción que está ganando interés, es la edición genómica por TALEN y CRISPR, que se ha convertido rápidamente en una herramienta muy útil en la biología molecular. Estas enzimas permiten a los científicos separar genes por lugares específicos y luego modificar los restos para producir una secuencia genómica de su interés. Sin embargo, las nucleasas programables no son originales y a menudo editar secuencias similares, modifica erróneamente unos cuantos pares de bases de una secuencia fuera de objetivo, por lo que es poco fiable para uso clínico debido a la posibilidad de mutaciones no deseadas.

Por esta razón, las células madre pluripotentes inducidas (células iPS) son modelos ideales, ya que proporcionan a los investigadores una gran cantidad de células del paciente en las que poner a prueba las nucleasas programables y encontrar las condiciones óptimas para que se minimicen las modificaciones fuera del objetivo. Científicos de CIRA han aprovechado esta funcionalidad mediante la generación de células iPS en un paciente DMD. Utilizaron varias TALEN y CRISPR diferentes para modificar el genoma de las células iPS, que luego se diferenciaron en células del músculo esquelético. En todos los casos, la expresión de la proteína distrofina mejoró, y en algunos casos, el gen de la distrofina fue totalmente corregido.

Una de las claves para el éxito, fue el desarrollo de un protocolo de cálculo que reduce al mínimo el riesgo de edición desviada. El equipo construyó una base de datos con todas las permutaciones de secuencias posibles de hasta 16 pares de bases de longitud. Entre éstos, se extrajeron los que sólo aparecen una vez en el genoma humano, es decir, secuencias únicas. La DMD puede ser causada por varias mutaciones diferentes, en el caso del paciente utilizado en este estudio, era un caso de supresión del exón 44. Los investigadores, por lo tanto construyeron un histograma de secuencias únicas que aparecen en una región genómica que contiene este exón. Encontraron gran cantidad de secuencias únicas en el exón 45. Según Akitsu Hotta, director del proyecto en Cira y miembro distinguido del Institute for Integrated Cell-Materials Sciences de la Universidad de Kyoto, «Casi la mitad del genoma humano, consiste en secuencias repetidas. Así que incluso si encontramos una secuencia única, un cambio de uno o dos pares de bases puede dar lugar a otras secuencias repetidas, que ponen en riesgo la TALEN o CRISPR editando una región incorrecta. Para evitar este problema, buscamos una región exitosa en el histograma».

Con este objetivo definido, el equipo consideró tres estrategias para modificar el campo de lectura de la mutación del gen de la distrofina: la omisión de exón mediante la conexión de los exones 43 y 46 para restaurar el marco de lectura, marco cambiante mediante la incorporación de mutaciones de inserción o supresión (in-del) y la técnica “exon knock-in”, insertando directamente el exón 44 antes del exón 45. Las tres estrategias incrementan eficazmente la síntesis de la distrofina en las células esqueléticas diferenciadas, pero sólo la técnica “exon knock-in”, recuperó el gen a su estado natural. Es importante destacar que la edición mostró una especificidad muy alta, lo que sugiere que su enfoque computacional se puede utilizar para reducir al mínimo la edición fuera de objetivo causada por las nucleasas de programación.

Por otra lado, el documento proporciona una Prueba de Principio para el uso de la tecnología de células iPS para tratar la DMD en combinación con TALEN o CRISPR. El equipo de investigadores pretende ahora ampliar este protocolo a otras enfermedades. La primera autora del estudio, Lisa Li explica, «Hemos demostrado que TALEN y CRISPR pueden ser utilizados para corregir la mutación del gen de la DMD. Quiero aplicar las nucleasas en corregir mutaciones tanto para otras enfermedades de base genética como para mutaciones puntuales».

*** Tinción inmunofluorescete de células diferenciadas a partir de células esqueléticas DMD-iPS. Las células esqueléticas con DMD no expresan la distrofina (verde) debido a la supresión del exón 44. Sin embargo, después de aplicar cualquiera de las tres estrategias a las células iPS, el resultado es la diferenciación en las células esqueléticas de la expresión normal de la distrofina. (Escala, 50 micras).

– 27 de Noviembre de 2014-.

Fuente:  www.cira.kyoto-u.ac.jp .

Detalles sobre el artículo:

Título: «Corrección precisa por TALEN y CRISPR-Cas9 del gen de la distrofina en las células iPS derivadas de un paciente con Distrofia Muscular de Duchenne».

Revista: Stem Cell Reports.

Autores: Hongmei Lisa Li, Naoko Fujimoto, Noriko Sasakawa, Saya Shirai, Tokiko Ohkame, Tetsushi Sakuma, Michihiro Tanaka, Naoki Amano, Akira Watanabe, Hidetoshi Sakurai, Takashi Yamamoto, Shinya Yamanaka, y Akitsu Hotta.